Penapis pendarfluor ialah komponen penting dalam mikroskop pendarfluor. Sistem biasa mempunyai tiga penapis asas: penapis pengujaan, penapis pelepasan dan cermin dichroic. Mereka biasanya dibungkus dalam kiub supaya kumpulan itu dimasukkan bersama ke dalam mikroskop.
Bagaimanakah penapis pendarfluor berfungsi?
Penapis Pengujaan
Penapis pengujaan menghantar cahaya dengan panjang gelombang tertentu dan menyekat panjang gelombang lain. Ia boleh digunakan untuk menghasilkan warna yang berbeza dengan menala penapis untuk membenarkan hanya satu warna melalui. Penapis pengujaan datang dalam dua jenis utama — penapis laluan panjang dan penapis laluan jalur. Penguja biasanya merupakan penapis laluan jalur yang hanya melepasi panjang gelombang yang diserap oleh fluorophore, dengan itu meminimumkan pengujaan sumber pendarfluor lain dan menyekat cahaya pengujaan dalam jalur pelepasan pendarfluor. Seperti yang ditunjukkan oleh garis biru dalam rajah, BP ialah 460-495, yang bermaksud bahawa ia hanya boleh melalui pendarfluor 460-495nm.
Ia diletakkan di dalam laluan pencahayaan mikroskop pendarfluor dan menapis semua panjang gelombang sumber cahaya kecuali untuk julat pengujaan fluorophore. Transmisi minimum penapis menentukan kecerahan dan kecemerlangan imej. Sekurang-kurangnya 40% penghantaran untuk mana-mana penapis pengujaan disyorkan supaya penghantaran adalah ideal> 85%. Lebar jalur penapis pengujaan hendaklah sepenuhnya berada dalam julat pengujaan fluorophore supaya panjang gelombang tengah (CWL) penapis adalah sehampir mungkin dengan panjang gelombang pengujaan puncak fluorophore. Ketumpatan optik penapis pengujaan (OD) menentukan kegelapan imej latar belakang; OD ialah ukuran sejauh mana penapis menyekat panjang gelombang di luar julat penghantaran atau lebar jalur. OD minimum 3.0 disyorkan tetapi OD 6.0 atau lebih adalah ideal.
Penapis Pelepasan
Penapis pelepasan berfungsi untuk membolehkan pendarfluor yang diingini daripada sampel mencapai pengesan. Mereka menyekat panjang gelombang yang lebih pendek dan mempunyai penghantaran yang tinggi untuk panjang gelombang yang lebih panjang. Jenis penapis juga dikaitkan dengan nombor, contohnya BA510IF dalam rajah (penapis halangan gangguan), sebutan itu merujuk kepada panjang gelombang pada 50% daripada penghantaran maksimumnya.
Pengesyoran yang sama untuk penapis pengujaan berlaku untuk penapis pelepasan: penghantaran minimum, lebar jalur, OD dan CWL. Penapis pelepasan dengan kombinasi CWL, transmisi minimum dan OD yang ideal memberikan imej yang paling terang, dengan sekatan sedalam mungkin, dan memastikan pengesanan isyarat pelepasan yang paling samar.
Cermin Dichroic
Cermin dichroic diletakkan di antara penapis pengujaan dan penapis pelepasan pada sudut 45° dan mencerminkan isyarat pengujaan ke arah fluorofor sambil menghantar isyarat pelepasan ke arah pengesan. Penapis dichroic dan pembahagi rasuk yang ideal mempunyai peralihan tajam antara pantulan maksimum dan penghantaran maksimum, dengan pantulan >95% untuk lebar jalur penapis pengujaan dan penghantaran >90% untuk lebar jalur penapis pelepasan. Pilih penapis dengan mengambil kira panjang gelombang persilangan (λ) fluorophore, untuk meminimumkan cahaya sesat dan memaksimumkan nisbah isyarat-ke-bunyi imej pendarfluor.
Cermin dichroic dalam rajah ini ialah DM505, dinamakan demikian kerana 505 nanometer ialah panjang gelombang pada 50% daripada penghantaran maksimum untuk cermin ini. Keluk penghantaran untuk cermin ini menunjukkan penghantaran tinggi melebihi 505 nm, penurunan tajam dalam penghantaran ke kiri 505 nanometer, dan pemantulan maksimum ke kiri 505 nanometer tetapi masih mungkin mempunyai beberapa penghantaran di bawah 505 nm.
Apakah perbezaan antara penapis long pass dan band pass?
Penapis pendarfluor boleh dibahagikan kepada dua jenis: laluan panjang (LP) dan laluan jalur (BP).
Penapis long pass menghantar panjang gelombang yang panjang dan menyekat yang lebih pendek. Panjang gelombang cut-on ialah nilai pada 50% penghantaran puncak, dan semua panjang gelombang di atas cut-on dihantar oleh penapis long pass. Mereka sering digunakan dalam cermin dichroic dan penapis pelepasan. Penapis laluan panjang harus digunakan apabila aplikasi memerlukan pengumpulan pelepasan maksimum dan apabila diskriminasi spektrum tidak diingini atau diperlukan, yang biasanya berlaku untuk probe yang menjana satu spesies pemancar dalam spesimen dengan tahap autofluoresensi latar belakang yang agak rendah.
Penapis laluan jalur hanya menghantar jalur panjang gelombang tertentu, dan menyekat yang lain. Mereka mengurangkan crosstalk dengan membenarkan hanya bahagian terkuat spektrum pelepasan fluorophore untuk dihantar, mengurangkan hingar autofluoresensi dan dengan itu meningkatkan nisbah isyarat-ke-bunyi dalam sampel autofluoresensi latar belakang tinggi, yang tidak dapat ditawarkan oleh penapis long pass.
Berapakah jenis set penapis pendarfluor yang boleh dibekalkan oleh BestScope?
Beberapa jenis penapis biasa termasuk penapis biru, hijau dan ultraviolet. Seperti yang ditunjukkan dalam jadual.
| Set Penapis | Penapis Pengujaan | Cermin Dichroic | Penapis Penghalang | Lampu LED Panjang Gelombang | Permohonan |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485nm | ·FITC: Kaedah antibodi pendarfluor · Jingga asid: DNA, RNA ·Auramine: bacillus tubercle ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535nm | ·Rhodamine, TRITC: Kaedah antibodi pendarfluor ·Propidium iodida: DNA ·RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365nm | ·Pemerhatian auto-pendarfluor · DAPI: pewarnaan DNA · Hoechest 332528, 33342: digunakan untuk pewarnaan Kromosom |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405nm | · Katekolamin · 5-hidroksi triptamin ·Tetrasiklin: Rangka, Gigi |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Set penapis yang digunakan dalam pemerolehan pendarfluor direka bentuk sekitar panjang gelombang utama yang digunakan dalam aplikasi pendarfluor, yang berasaskan pendarfluor yang paling banyak digunakan. Atas sebab ini, ia juga dinamakan sempena fluorophore yang dimaksudkan untuk pengimejan, seperti kiub penapis DAPI (biru), FITC (hijau) atau TRITC (merah).
| Set Penapis | Penapis Pengujaan | Cermin Dichroic | Penapis Penghalang | Lampu LED Panjang Gelombang |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535nm |
| FL-Auramine | BP470 | DM480 | BA485 | 450nm |
| Texas Red | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560nm |
Bagaimanakah anda memilih penapis pendarfluor?
1. Prinsip memilih penapis pendarfluor adalah untuk membiarkan cahaya pendarfluor/pancaran melepasi hujung pengimejan sejauh mungkin, dan menyekat sepenuhnya cahaya pengujaan pada masa yang sama, untuk mendapatkan nisbah isyarat-ke-bunyi yang tertinggi. Khususnya untuk penggunaan pengujaan multifoton dan jumlah mikroskop pantulan dalaman, bunyi yang lemah juga akan menyebabkan gangguan yang besar kepada kesan pengimejan, jadi keperluan untuk nisbah isyarat kepada bunyi adalah lebih tinggi.
2. Mengetahui spektrum pengujaan dan pelepasan fluorofor. Untuk membina set penapis pendarfluor yang menghasilkan imej kontras tinggi berkualiti tinggi dengan latar belakang hitam, penapis pengujaan dan pelepasan harus mencapai transmisi tinggi dengan riak jalur laluan minimum ke atas kawasan yang sepadan dengan puncak pengujaan fluorophore atau pelepasan.
3. Pertimbangkan ketahanan penapis pendarfluor. Penapis ini mestilah kalis kepada sumber cahaya sengit yang menjana cahaya ultraungu (UV) yang boleh menyebabkan "keletihan", terutamanya penapis penguja kerana ia tertakluk kepada keamatan penuh sumber pencahayaan.
Imej Sampel Pendarfluor Berbeza
Sumber dikumpul dan disusun di Internet, dan hanya digunakan untuk pembelajaran dan komunikasi. Jika terdapat sebarang pelanggaran, sila hubungi kami untuk memadam.
Masa siaran: Dis-09-2022